骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞体外构骨的超微结构

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨形态发生蛋白被证实有成骨诱导作用，然而关于骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞成骨的超微结构研究尚未见报道。
目的：观察骨膜细胞经成骨因子骨形态发生蛋白7诱导后的生物活性及超微结构。
方法：实验取材于成人胫骨。分离出原代骨膜细胞后行常规体外培养，实验分为实验组和对照组。实验组加入骨形态发生蛋白7和细胞培养辅助剂，对照组仅仅加入了成骨细胞培养辅助剂。每组分别在第5，10，15天设3个时间点，每个时间点设3个样本，分别行钙结节的染色及采用相差显微镜观察大体形态结构，在透射电镜下观察超微形态结构。
结果与结论：实验组和对照组形成的成骨细胞增殖良好，形态一致。细胞早期呈梭形，立体感强，饱满透明，分裂期呈短柱状或立方形，电镜下见成骨细胞内有大量的粗面内质网和高尔基复合体；后期细胞由长梭形逐渐变成宽梭和不规则形，后期射透电镜下可见细胞内有大量基质小泡，有膜包被，胞质内上有碱性磷酸酶及钙结合蛋白，泡内有钙盐结晶，成骨细胞的基底部和侧面出现突起与邻近的骨细胞突起相连。由骨形态发生蛋白7诱导的成骨细胞在体外增殖更快，细胞分裂及成骨速度更快。结果提示骨形态发生蛋白7在体外培养中具有明显增强成骨细胞增殖的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 骨形态发生蛋白7, 成骨细胞, 细胞培养, 超微结构

Abstract:

BACKGROUND: Study confirms that bone morphogenetic protein can induce osteogenesis; however the ultrastructure of periosteal cells induced by bone morphogenetic protein-7 remains poorly reported.
OBJECTIVE: To study the bioactivity and ultrastructure of periosteal cells induced by bone morphogenetic protein-7 in vitro.
METHODS: The primary periosteal cells isolated from adult tibial bone were in vitro cultured, and then divided into experimental group and control group. In the experimental group, cells were cultured with bone morphogenetic protein-7 and culture adjuvant; while cells in the control group were only cultured with the adjuvant. Three samples in each group were tested at 5, 10, 15 days, respectively. The general structure of cultured cells was observed using von Kossa staining, and the ultrastructure was observed under transmission electron microscopy.
RESULTS AND CONCLUSION: The periosteal cells in the two groups grew well in vitro, showing uniform morphology. Early cells were spindle-shaped, with strong three-dimensional sense and full transparency; mitotic cells were short columnar or cubic shaped, there were a lot of rough endoplasmic reticulum and Golgi complex in osteoblasts under electron microscope. Later stage of cells developed from long fusiform into wide shuttle and irregular shape, there were a large number of matrix vesicles within the cells under the electron microscope. The membrane coating, alkaline phosphatase and calcium-binding protein in the cytoplasm, as well as calcium crystals were found. The osteogenesis basement and lateral sides appeared projections, which were connected with adjacent bone cells. Induction of bone morphogenetic protein-7 in vitro promotes the osteoblasts proliferation, division and bone formation speed. The results suggest that bone morphogenetic protein-7 can significantly enhance the proliferation ability of osteoblasts in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: bone morphogenetic protein-7, osteoblasts, cell structure

中图分类号:

R318

廖家成，贝抗胜，连银川，徐进文，刘延晓，黄晓瑜. 骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞体外构骨的超微结构[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(33): 5288-5292.

Liao Jia-cheng, Bei Kang-sheng, Lian Yin-chuan, Xu Jin-wen, Liu Yan-xiao, Huang Xiao-yu. Ultrastructure of periosteal cells induced by bone morphogenetic protein 7 in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(33): 5288-5292.

图/表（结果） 4

2.1 组织块的分离和原代骨膜细胞的形态学观察结果组织块培养第4天，光镜下见呈放射状围绕组织块，骨膜组织块周围可见贴壁细胞，细胞早期形态呈短梭形，或细圆形，核位于中央，轮廓清晰，饱满透明，立体感强，随着培养时间的增加，细胞增殖迅速，圆形细胞减少，梭形细胞增多，逐渐呈宽梭和不规则型，约7 d后细胞铺满瓶底，获得原代骨膜细胞。

2.2 传代细胞的普通培养及形态学观察结果传代后，获得原代细胞，每天由相差显微镜观察细胞，见细胞24 h可以贴壁，培养2 d时细胞开始铺展，多称三角形及梭形，细胞体积较原代大，形态更加均一。培养4 d时可见细胞形态多样，铺展于培养瓶，突起较多，相互接触；6 d时细胞数目开始增多，细胞呈长梭形呈立方形的成纤维细胞样，并形成集落，约1周细胞长满瓶底，接触紧密，且随着传代次数的增加胰酶消化脱壁的时间也较原代细胞明显缩短(图1)。

2.3 实验分组后传代细胞的形态学观察结果

相差显微镜下观察，细胞培养初期(传代后第5天)：细胞数量较少，细胞形状多为梭形或三角形，略光滑，细胞突起较少。细胞数量明显增多，细胞形状多样，大量纤维样伪足于其他细胞伪足交织成三维网状。有少量细胞聚集，电镜下观察见细胞核规则，常位于细胞的一侧，常染色质丰富，核仁少见。胞质中可见散在的线粒体、内质网、高尔基复合体，可见有较多溶酶体，表现为多个高电了密度的小泡。

相差显微镜观察细胞培养后期(传代后第15天)：细胞数多，排列紧密；胞体较大，细胞核核大，细胞核呈分叶状，电镜下可见一两个核仁，核仁致密，核膜光滑清晰，有凹陷。胞浆内细胞器明显增多，线粒体丰富，嵴少，电子密度高。胞浆内有丰富的粗面内质网，Golgi复合体,粗面内质网末端膨大成池，内充以低电子密度物质,表面有核糖体, 大量分泌小泡散在分布，少量溶酶体。出现基质小泡，基质小泡内充满中等电子密度物质，同时能见到部分衰老、凋亡的细胞，细胞内出现了大量空泡(可能来源于线粒体肿胀变性)，周围出现双层膜空泡结构，有些细胞完全崩解。

2.4 单纯应用成骨培养辅助剂的对照组体外骨膜细胞普通培养的形态学观察结果骨膜细胞24 h后贴壁，相差显微镜观察见早期呈梭形, 饱满透明, 立体感强；个别可见细胞两极有细丝状突起，随后开始增殖，72 h后细胞增殖分裂迅速，分裂期呈立方形或短柱状，体积逐渐增大，向成纤维细胞状改变逐渐变成宽梭和不规则形，后期细胞排列紧密，成漩涡状生长，细胞之间无接触抑制现象，呈典型的长梭形、平行或旋涡状排列，集落间出现重叠。

2.5 骨形态发生蛋白7诱导后的实验组细胞形态学观察结果加入骨形态发生蛋白7及辅助剂后，细胞生长速度明显增加，细胞初始仍为长梭形，随时间延长逐渐变成多边形和三角形，与成骨细胞形态相似，并能增殖形成细胞集落(图2)。

2.6 成骨细胞超微结构的观察结果电镜下实验组比对照组有更多的粗面内质网、高尔基复合体及高电子密度的基质小泡，基质小泡内有钙结合蛋白和碱性磷酸酶，泡内有细小的钙盐结晶(图3)。

2.7 成骨指标检测结果经骨向诱导剂及骨形态发生蛋白7诱导5，10，15 d实验组细胞钙结节染色阳性率均较单纯骨向诱导剂的对照组显著增高，差异有非常显著性意义(P < 0.01，表1)。

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引言

骨组织工程中关于选用何种种子细胞，以及体外选用什么支架体外构骨的研究比较多，但是关于种子细胞在体外构骨的超微结构观察的相关研究比较少，关于骨膜细胞体外培养超微结构改变的形态学研究也比较少。成骨因子是在骨形成过程及骨相关疾病过程中，骨膜细胞、成骨细胞及软骨细胞表达的因子。在骨病及骨形成中有多种因子的表达，目前，这些因子已经被广泛研究，发现许多因子能在体外诱导软骨成骨，或诱导骨膜细胞成软骨细胞。同时发现多种疾病和某些成骨因子表达的缺失有关系，并且现在越来越多的成骨因子用于骨组织工程及临床中，其效果已经得到了临床证实。

目前骨膜来源的骨膜细胞、骨组织来源的骨膜细胞、骨髓来源的基质干细胞和骨外组织来源的干细胞均可作为骨组织工程种子细胞，这些细胞从取材、培养、与材料复合、体内植入到最终形成骨组织均已被实验证实具有确切的成骨能力。体外培养条件下，骨膜来源的骨膜细胞具有很强的传代增殖和稳定的定向分化能力，较骨髓基质干细胞具有更强的成骨能力，体内植入后能很好地适应受区环境，并保持良好的成骨活性，最终通过软骨化骨修复骨缺损。

然而在骨组织工程中，检测种子细胞受到因子刺激后体外增殖的情况最直观的方法是观察其形态学的改变。骨组织工程体外构骨最终是需要钙质的聚集，种子细胞在体外构骨中钙的表达尤其重要，本实验采用Von Kossa法体外检测钙结节，并且用透射电子显微镜观察细胞内钙质小泡的数目和聚集情况。

目前骨组织缺如或损伤的修复是骨科临床治疗的难题，如何进行骨的重建与修复已成为当前研究的重要课题。骨膜细胞具有很强的增殖能力，有研究证实骨膜细胞体外培养仍然具有良好的成骨能力^[1]，细胞自体移植于骨缺损区仍能保持成骨活性，能促进骨修复^[2]，因此可作为组织工程的种子细胞。本实验在体外培养的骨膜细胞中，应用骨形态发生蛋白7对其进行诱导成骨，采用相差显微镜和电子显微镜观察其大体形态学和超微形态结构的改变。以此为体外大量骨块获取提供一条新的更好的途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：分组对照细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年6月至2014年5月在复旦大学完成。

材料：

成骨细胞培养辅助剂：传代细胞培养液+β2-甘油磷酸钠80 mg/L+地塞米松10 mol/L+维生素C 80 mg/L，pH 7.3。

骨膜细胞取材：骨膜取于正常人胫骨上段(术中胫骨开放手术患者，已经签署知情同意书)，取材时剔除其表面的肌肉等软组织，用尖刀切穿1 cm×1 cm的骨膜全层后，用骨膜剥离器仔细剥离紧贴骨皮质表面下的骨膜。

实验方法：

骨膜细胞体外培养：骨膜用PBS冲洗干净，剪成 1 mm×1 mm碎块，置于DMEM/F12培养液(含体积分数 15%小牛血清、青霉素100 U/ mL、链霉素100 U/ mL)，体积分数5%CO₂ 37 ℃恒温培养原代细胞。培养液分期分量更换，三四天后首次半量换液，更换培养液时将未贴壁细胞弃掉。人骨膜细胞原代培养方法同文献[3]。将原代骨膜细胞制成细胞悬液，接种于培养瓶内，加入含体积分数10%小牛血清的DMEM/F12培养基，在37 ℃，体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养。每隔三四天更换1次培养液。相差显微镜下观察见骨膜细胞融合至约90%时，用0.25%胰蛋白酶消化3-5 min后离心，吹悬，按1∶3比例传代培养，传至3代后进行实验。

实验分组及诱导培养：

实验分组：实验分为2组，骨形态发生蛋白7及成骨培养辅助剂的实验组和单纯应用培养辅助剂的对照组。将传至3代的骨膜细胞制成浓度为1×10⁸ L^-¹细胞悬液，按2×10⁴个/孔的细胞数目分别接种在24孔板中进行培养。待培养 24 h细胞贴壁后，实验组加入骨形态发生蛋白7(40 µg/L)及辅助剂(体积分数10%胎牛血清+DMEM/F12+100 U/mL青链霉素+0.1 µmol/L地塞米松+10 mmol/L β甘油磷酸钠+ 50 mg/L维生素C)，对照组单纯加入细胞辅助剂。细胞置于体积分数5%CO₂，37 ℃培养箱培养。约每2 d换液1次。

主要观察指标：

形态学观察：普通培养的骨膜细胞每日于倒置显微镜下观察骨膜细胞生长情况记录其形态。细胞扩增到分组后，在第5，10，15天分别于相差显微镜观察其形态，于第５天和第15天取出细胞于射透电镜下观察其形态结构。

骨指标检测：钙结节是成骨细胞分化的标志物，钙结节是骨膜细胞成骨化过程中形成的钙质沉积结节，是骨膜细胞成骨化的重要标志。其活性高低基本上可以反映出细胞的成骨分化能力。分别在5，10，15 d时取出细胞爬片，进行成骨细胞标志物钙结节染色检测。①PBS冲洗2次， 3 min/次。②多聚甲醛固定8 min。③蒸馏水冲洗2次。④5%硝酸银紫外下照20 min。⑤蒸馏水冲洗2次。⑥入2%硫代硫酸钠5 min。⑦水洗封固，镜检。显微镜下观察阳性细胞染色呈棕黑色，没有钙沉积则不显色。阳性细胞计数方法：每张盖玻片随机计数100个细胞，采用网格计数法，分别计算对照组和实验组的钙结节阳性率。

统计学分析：所有数据均用SPSS 17.0软件分析，数据以x(_)±s表示，对组间变量采用配对t 检验进行统计学分析。

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讨论

骨组织工程中，要解决的关键的两个问题是种子细胞和诱导因子。细胞因子能促进或抑制细胞的增殖、分化、迁移和基因的表达。骨组织工程涉及的细胞因子众多，其中主要的有：骨形态发生蛋白、转化生长因子β、血小板衍生生长因子、类胰岛素生长因子Ⅰ和Ⅱ、碱性和酸性成纤维生长因子、血管内皮细胞生长因子、白细胞介素1、肿瘤坏死因子等，其中骨形态发生蛋白是目前已知的最有效的促骨生长因子。它是广泛存在于动物骨骼、牙齿中的一族低分子糖蛋白多肽，在骨形成中起着重要的作用。骨组织工程中常用的诱导因子是骨形态发生蛋白^[1-2,4] 骨形态发生蛋白质类除骨形态发生蛋白1的外构成一个结构和功能相似的多肽因子家族，同属于转化生长因子β超家族的成员^[4]。骨形态发生蛋白(骨形态发生蛋白2，4，7)是目前发现唯一的一类具有异位成骨能力的细胞因子，能强力的刺激骨成骨细胞的分化基于骨形态发生蛋白的安全性和高效诱导成骨活性被越来越多的实验所证实^[5-10]，骨组织工程中常用的骨形态发生蛋白是骨形态发生蛋白2，有学者证实骨形态发生蛋白2因子对成骨细胞、骨髓基质细胞，骨间质干细胞，骨祖细胞均有促进成骨作用^[11-12]，骨形态发生蛋白7对骨膜细胞的诱导作用的报道比较少^[13]。有学者采用原位杂交技术观测到骨形态发生蛋白7在犬恒牙牙根发育早期和成牙骨质细胞本质细胞中有表达^[14]。祝联等^[15]对骨形态发生蛋白7对骨髓基质细胞成骨作用做了相关研究，认为骨形态发生蛋7对骨髓基质细胞有促进其分化成骨作用。因此骨形态发生蛋白7可作为骨生长的重要表达因子在骨组织工程中被采用。

骨形态发生蛋白7能强力促进骨祖细胞的分化，它能刺激间充质干细胞向软骨细胞和成骨细胞方向分化，能抑制骨细胞的凋亡^[16-17]。骨形态发生蛋白7对骨祖细胞的扩增作用和剂量密切相关，40 μg/L的骨形态发生蛋白7的浓度能刺激骨间充质干细胞向成骨细胞转化、能促进骨的形成。然而需要100 μg/L的骨形态发生蛋白2才能有足够的效果以促进骨间充质干细胞和成骨细胞的矿化和分化^[18]。这些数据表面，骨形态发生蛋白7比起其他的骨形态发生蛋白家族的因子来说根据具有促进骨祖细胞分化的能力。骨形态发生蛋白7能促进骨髓基质细胞的增殖和分化，其作用呈双向作用，在低浓度的时能促进骨髓基质细胞的增殖和分化，在高浓度时候则是一个抑制的作用。在高浓度时，脂肪细胞的数量下降而碱性磷酸酶染色阳性的成骨细胞数量则上升。骨形态发生蛋白的促进分化功能并不是与其促进增殖的功能呈完全线性并行的，但是骨形态发生蛋白能同时促进细胞的增殖和分化。早期使用骨形态发生蛋白刺激细胞能出现最大增殖的效果，在促进细胞分化方面，早期使用骨形态发生蛋白7比晚期更加敏感^[19]。在相同的条件，骨形态发生蛋白7同时促进了软骨骨细胞和脂肪细胞的增殖和分化^[20]。

目前常用的骨组织工程种子细胞包括骨膜来源的骨膜细胞、骨组织来源的骨膜细胞、骨髓来源的基质干细胞和骨外组织来源的干细胞。骨膜细胞是成骨细胞的前体细胞，大量的骨膜细胞位于骨膜生发层，在不同的诱导因子的作用下，可向成骨化及软骨化两个方向分化，类似于骨髓基质细胞或骨祖细胞体外培养条件下，骨膜来源的骨膜细胞具有很强的传代增殖和稳定的定向分化能力，较骨髓基质干细胞具有更强的成骨能力，体内植入后能很好地适应受区环境，并保持良好的成骨活性，最终通过软骨化骨修复骨缺损^[21-22]。贝抗胜等^[23]经实验证实骨膜细胞植入机体后能适应受区环境,保持成骨活性，并促成基质矿化形成骨组织，具有良好的成骨和再生能力，在骨骼的成长发育和修复过程中发挥重要作用选用骨膜细胞作为种子细胞有很大的优势：①不受供体来源限制，来源广泛，取材方便且对机体无损伤作用。②可在体外大量培养扩增。③在适当因子诱导下可向成骨或软骨方向分化。④自体细胞培养后移植，可避免异体组织移植中的组织配型和免疫排斥反应。

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